“scRNA-seq”到底有多少方法？

1、单细胞转录组建库方法分类

目前单细胞转录组的建库方法基本可以按照技术方案分为两类：

1）一类依赖于孔板

通俗的说，就是将已经解离的单个细胞分配到孔板中各自的孔中，在孔中单个细胞完成裂解、RNA富集、加细胞条码( cell barcode )和单分子识别码(UMI)等步骤后再收集到一起进行测序。

而具体的实施方案会根据每种建库方案有一些特色型的变动。目前这一类方法包括CEL-seq、CEL-seq2、SMART-seq、SMART-seq2、Microwell- seq等。

特点:

a.基于孔板的建库方法总体来说难以达到很高的通量

如SMART-seq2是基于96孔板，那么同批次只能测96个单细胞；microwell-seq通过缩小孔的体积扩大了可以同批量测序的细胞数目。

b.有基于全长转录本进行测序的条件

2）另一类依赖于液滴

大致可以理解为通过微流控技术将单个细胞和一个捕获RNA的微珠(beads)包裹在液滴中，beads连接的mRNA捕获oligo上已经预先包含cell barcode和UMI信息，在液滴中完成至少mRNA的富集后再将微珠合并，完成建库并测序。

具体的实施方案也是随着不同的方法学有些许差异。目前这-类方法包括Drop-seq、inDrop、10x genomics等。

特点:

a.基于微流控液滴的单细胞测序建库的优点是可以短时间内同批次处理更多细胞(数千以上)，但由于beads对mRNA的捕获率所限，这种方法在获得细胞数量的突破的同时，可以测到的基因数减少。

b.这类方法仍主要采用3'末端建库的方式(只取cDNA的3'末端测序)，所以在基因比对和定量的准确度上有所不及。

3）其他

SPLiT-seq以细胞本身作为“EP管"，将细胞膜穿孔后进行多轮split-pool的原位barcode连接，待每单个细胞内的RNA理论上均带有细胞特异性tag后再pool together。

2、几种常用的scRNA-seq实验方法

图片来源：【豪克博士聊科研】教你单细胞测序（五）操作流程（4） - 知乎

目前常见的单细胞测序方法主要有：Smart-seq2、CEL-seq2、sci-RNA-seq、10x Chromium、Drop-seq、Seq-Well、inDrops。

图片来源：单细胞转录组测序简介-OmicsClass

其中Smart-seq2、CEL-seq2是基于微孔板的方法进行测序，属于低通量测序。

sci-RNA-seq是基于微孔板组合的方法来隔离细胞并标识细胞，属于高通量的分析方法。

10x Chromium、Drop-seq、inDrops是基于微流控产生的油包水的方法来隔离细胞，并且是用带barcode序列的引物微珠来标识细胞的，是高通量的方法。

Seq-Well采用微孔芯片来隔离细胞，再用微珠来标识细胞，属于高通量方法。

1）Drop-seq

Drop-seq是一种基于使用微流体技术快速分析数千个单细胞的方法，Drop-seq测序的原理是利用微流控装置将带有条形码的微珠和细胞一起装入微液滴，该微液滴相当于一个纳升大小的反应室，可以将单个细胞进行分离，从而单独进行建库和测序。

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Drop-seq针对cDNA的3'末端测序。

2）CEL-seq／CEL-seq2

❶CEL-seq

CEL-seq通过体外线性扩增（In vitro transcription, IVT）实现单细胞测序。

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a.RT

分离单细胞后，利用含条形码（barcode）的引物对每管的单细胞进行逆转录。

该引物含有锚定的ploydT、barcode、5' Illumina测序接头和一个 T7 promoter。

b.cDNA第二链的合成

合成第二条链后，形成的就是双链的DNA。

c.体外转录

将所有的cDNA样本混合到一起，以达到足以进行体外转录（In vitro transcription, IVT）的模版量。

T7 promoter用于启动IVT，以第二条合成的DNA 为模版转录RNA（所以此时的RNA序列与原 mRNA序列是反向互补的，即antisense RNA，aRNA），此时5'端最外为Illumina 5' adaptor。经过多轮 IVT，实现模版的线性扩增。

d.文库构建

扩增好的RNA进一步进行片段化（适合测序的片段长度），同时在RNA的 3' 加接头(Adaptor)。

进一步对这些RNA进行反转录为DNA，同时进行 PCR 扩增，扩增后的片段即为建好的库，然后对这些片段进行paired-end测序。read1记录barcode信息，read2用于确定mRNA。

❷CEL-seq2

CEL-seq2与CEL-seq的不同主要体现在使用了 Fluidigm C1微流体平台，同时引物增加了 UMI 部分，确保每一个反转录mRNA被精确的计数一次。

图片来源：这么多单细胞测序平台，我该选哪个？-知乎

相较 CEL-seq，做出了一些改进：

图片来源：你真的搞懂了单细胞转录组吗？-科研这点事儿

a.RT引物中加入了一段6nt的UMI，将8nt的 barcode缩短至6nt，并缩短T7引物和Illumina 5'接头，使引物总长从92nt缩短至82nt，提升了RT效率。

b.RT时使用SuperScript II，并在第二条链合成时使用SuperScript II Double-Stranded cDNA Synthesis Kit。

c.改进了去除 dsDNA和 aRNA的过程，提高产量。

d.IVT得到的RNA在反转录时，直接插入接头，不需要进行连接。

3）MARS-seq

MARS-seq的原理与CEL-seq类似，均是通过T7 启动子连在oligo dT引物上，可以在cDNA合成后启动IVT。

图片来源：【豪克博士聊科研】教你单细胞测序（五）操作流程（4） - 知乎

但与CEL-seq不同的是，MARS-seq在单细胞分离时，主要使用的是FACS流式分选，而CEL-seq2/C1单细胞采用细胞稀释法。

MARS-seq2.0是在MARS-seq基础上，整合index 分选以及大量平行单细胞RNA测序方法，从而形成的一套流程。MARS-seq2.0引物包含T7启动子、6bp的barcode 以及8bp的UMI，待单细胞被FACS分选后，进一步将单细胞置入384孔板中。

4）SCRB-seq

SCRB-seq与Smart-seq相似，均是通过PCR的方式对扩增cDNA进行扩增。

但与Smart-seq不同的是，SCRB采用UMI主要对 RNA 3'进行富集，而Smart-seq对mRNA的全长进行分析，两者还是不一样的。

SCRB-seq的主要流程：

a.FACS单细胞分选后，加入微孔中；

b.裂解细胞，反转录为cDNA，引物含有oligo dT、10bp UMI、6bp barcode以及PCR引物部分；

c.第二链的扩增，主要采用PCR的方式进行扩增；

d.进一步对扩增后产物进行PCR指数扩增；

e.PCR产物片段化并进行3' 端富集；

f.建库测序。

5）inDrop-seq

inDrop，Drop-seq和10X Genomics使用相似的原理产生微滴，且磁珠引物具有相同的结构，包括PCR柄、细胞条形码、特异性分子标记（UMI）和poly-T。

❶inDrop，Drop-seq和10X Genomics差异点

图片来源：国人一区作品：基于微滴的超高通量单细胞RNA-Seq系统的比较分析（IF=14.548）-小桔灯网

a.inDrop系统磁珠引物包含光裂解序列和T7启动子。

b.磁珠材料：10X和inDrop系统使用的磁珠是水凝胶制成的，Drop-seq使用的是脆性树脂。

c.10X Genomics磁珠和inDrop磁珠可以固定整个珠子的引物，而Drop-seq磁珠只能在表面携带引物。

d.通常，微滴和细胞以低浓度引入，以减少形成双重态的机会；也就是说，两个细胞或两个珠子被封装在一个微滴中。包封后，10X Genomics整粒磁珠溶解，将所有的引物释放到溶液中，提高mRNA的捕获效率。inDrop通过uv照射，通过裂解来激活引物。Drop-seq使用表面连接的引物来捕获mRNA分子。

e.反转录位点：10X Genomics和inDrop是在微滴内进行，相反，Drop-seq只捕获转录本，没有进行反转录。

f.cDNA扩增方式：inDrop使用CEL-seq，而10X Genomics和Drop-seq遵循template-switching，类似于流行的Smart-seq。

g.文库制备时间：inDrop的微滴外转录，文库制备时间延长至24小时以上，而Drop-seq和10X Genomics均可在一天内完成。

❷inDrop-seq建库流程

a.在微流设备中有4个输入通道，分别是BHMs，细胞，RT/lysis试剂以及油，封装成微滴；

b.利用UV释放BHMs上的引物，与裂解细胞得到的 mRNA结合，进行RT；

c.破坏微滴后将所有cDNA整合，按照CEL-seq protocol进行测序；

图片来源：文献解读 用于研究发育、生理和疾病的单细胞RNA测序_scRNA-

6）CITE-seq

CITE-seq是利用寡核苷酸标记的抗体，对细胞表面蛋白和转录组同时进行测定的技术。

单细胞测序的部分和10X的原理是一样的，只是CITE-seq在原有单细胞测序的基础上加了抗体，抗体可以结合到细胞表面相应的蛋白上，抗体上带有特殊的DNA标签。

❶CITE-seq建库流程

a.设计DNA-barcoded antibodies

通过链霉亲和素-生物素互作，将寡核苷酸5'端与抗体相连，而这种通过二硫键的结合会在还原条件下断裂，释放寡核苷酸。

图片来源：CITE-seq：同时测细胞表面蛋白和RNA的单细胞测序

寡核苷酸中包括用于PCR扩增的handle，用于抗体身份识别的barcode，以及能与oligo-dT引物结合的一段polyA序列。

b.液滴生成

将antibody-oligo复合物与单细胞悬液共孵育（条件设置参照流式细胞染色），抗体和细胞结合后洗去未结合的抗体，随后样本即可对接10x技术被分成油包水小液滴。

c.细胞裂解和逆转录

细胞裂解，使得带有oligo-dT的beads与细胞 mRNA及抗体-寡核苷酸复合物3'端的polyA尾巴结合，然后对同一细胞的mRNA和寡核苷酸进行RT 和PCR，并标记上相同的cell barcode。

扩增了的来源于抗体的序列(ADTs)和cDNA分子能够通过大小区分开，从而分别进行Illumina测序文库的制备。

由于两种文库可以独立生成，因此可以调整其在单个lane中的比例以确保各自所需的测序深度。

❷CITE-seq的优点

a.同时测mRNA+蛋白信息，数据更丰富，对细胞的注释更准确，有助于发现新的细胞类型。

b.由于barcode的存在，CITE-seq检出的mRNA+蛋白是可以对应的，也就是说是可以同时得到每个细胞的mRNA+蛋白表达量。

c.与流式细胞相比，CITE-seq又可以不受抗体之间信号干扰的影响，大大增加了表面蛋白标记的数量(一次可以检出多达100个的蛋白)，从而可以一次性获得多种由抗体蛋白指示的免疫表型的信息。甚至，如果关注点在细胞蛋白上，ADTs可以独立于细胞的mRNA而单独测序、分析。

d.CITE-seq能够与10X Genomics无缝衔接，方便易操作。

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