教你用荧光定量PCR仪（ABI 7500）

打开电脑及仪器电源，双击电脑桌面上的7500 software图标打开程序。

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软件主界面：

图片来源：7500/7500 Fast Real-Time PCR System GETTING STARTED GUIDE

实验设置：

a.实验名称

b.仪器型号

c.实验目的：定量、Genotyping(基因分型)、定性（有/无）

d.定量类型：标准曲线、相对标准曲线、相对定量

e.实验方法：探针法、染料法

f.模板类型：gDNA、cDNA

g.Target设置：Target包括目的基因、内参基因（多少个和名称）。

探针法需要选择使用的荧光基团和淬灭基团。

h.标准曲线设定：几个点、每点几个重复、定义标准量范围。

图片来源：qPCR进阶攻略——带你玩转qPCR仪器设置！-Yeasen

i.样本设置：Sample包括实验组、对照组、负对照组；样本数、每样本重复数、阴性对照数、样本选择和命名。

j.反应孔的设置：根据样品的排布选中面板上的加样孔，勾选左边对应的目的基因及模板。

注意：不应为了方便将所有孔选成同一个Target同一个Sample，这样排布会造成比较大的风险。我们通过下面的例子进行说明：

图片来源：qPCR进阶攻略——带你玩转qPCR仪器设置！-Yeasen

我们同一块板上同时扩增两个基因，而布孔时选成同一个Target，那么仪器默认的都是同一个阈值，假如布孔时都选成Target1，红色这条阈值线对于Target1是合理的，但对于Target2则不合理，因为这时已经不在指数扩增期，得到的Ct值并不可信。

反应程序设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的Master Mix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10分钟）。

a.反应体系设置：

反应体系的配制，不得不说到参比／校正染料（reference dye，passive dye）。常用的是ROX或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。

参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROX配制在MasterMix或者Premixture里，也有的是单独分开。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROX染料校正。比如Bio-RAD的系列仪器就不需要。

需要注意一点ABI仪器的需要加ROX参比染料的，默认的是ROX，要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。如BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择“none"。

b.两步法或三步法：qPCR反应可以将退火与延伸两步进行合并，条件需要根据引物和目的基因的长度进行调整，根据qPCR引物设计原则，引物的Tm值在60℃左右，因此这一步的温度一般可设为60℃。

c.荧光信号采集：对于染料法而言，两步法检测的荧光信号采集应该在退火延伸的整合步骤；三步法应当在72℃延伸时采集，此时绝大部分的DNA是双链状态；Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。以ABI 7500为例，选择在哪一步采集荧光信号点亮其下面的小方块即可。

d.熔解程序：使用染料法进行荧光定量PCR时，我们通常会在扩增阶段完成后进行熔解曲线分析，帮助确定产物类型，判断是否有非特异性扩增的产生。

以SYBR Green法为例，SYBR Green染料只有结合到双链DNA的小沟中才能发出荧光，扩增反应完成后，对产物逐渐升温同时监测每一步的荧光信号，随着温度升高，DNA双链解开，产物荧光信号下降。

溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。温度一般设置在60℃-95℃区间，能包含产物Tm值和非特异产物Tm值即可。在某个温度下，双链DNA会解链一半，此后剩下的一半会迅速解链，荧光骤降并形成变化的拐点，这个温度称为退火温度（Tm值）。将温度与荧光强度的变化求导作图(-dI/dT)，从而生成熔解曲线。

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RUN：全部设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！

数据分析：

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